Секвенирование дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) (11714)

Посмотреть архив целиком














Реферат на тему:


Секвенирование ДНК













2009


Введение


К концу 70-х годов перед исследователями, работавшими в сфере молекулярной биологии, остро встала проблема установления последовательности нуклеотидов в цепи ДНК («секвенирования ДНК»). Как подойти к решению этой проблемы? За 10 лет до того Эрдманом и Беггом была решена задача выяснения последовательности аминокислот в белках («секвенирования белков») в автоматическом режиме. С этим решением мы уже ознакомились. Собственно говоря, новым в их методе был только способ автоматизации. Существо же этого метода было для химии тривиальным. Был найден способ последовательного отщепления по одной аминокислоте (хотя и в модифицированном виде) от конца изучаемой белковой цепи с последующей идентификацией каждого из полученных таким образом простых продуктов.

Отыскание аналогичного подхода для секвенирования ДНК не вдохновляло исследователей, поскольку для секвенирования хотя бы одного структурного гена предстояло определять последовательность в 1—3 тысячи нуклеотидов, не говоря уже о всем геноме, когда счет должен идти на миллионы, а у высших организмов на миллиарды нуклеотидов.




Первоначальные способы не автоматизированного секвенирования ДНК


В 1977 году Максам и Гилберт предложили совершенно иной, оригинальный метод решения проблемы секвенирования. Им удалось найти химическую реакцию, которая расщепляла молекулу ДНК по месту расположения одного определенного нуклеотида. Они помечали радиоактивной меткой первый нуклеотид исследуемого однонитевого (после денатурации) фрагмента ДНК, представленного, разумеется, огромным количеством копий. Затем проводили реакцию расщепления в таких условиях, что подавляющее большинство нитей ДНК разрывалось только в одном из множества мест, где стоял избранный нуклеотид (а все эти места равноправны). После этого продукты расщепления направлялись для анализа методом электрофореза в ПААГ. Ауторадиография геля выявляла следующую картину.

Отрезки ДНК всех возможных размеров, считая от начала молекулы до известного (подвергшегося химической атаке) нуклеотида, разделились и обнаружили себя полосами почернения рентгеновской пленки. Самые короткие отрезки (в 2, 3 и даже один первый нуклеотид) ушли в геле далеко вперед. Более длинные отрезки отстали тем сильнее, чем они были длиннее. Степень почернения полос оказалась разная, поскольку число молекул ДНК, разорвавшихся в каждом из возможных мест было случайным. Но при достаточном количестве исходного материала все они были хорошо видны. «Отрезанные» части молекул, напротив, ничем себя в геле не проявляли, так как не содержали меченого нуклеотида.

Эта картина еще не несла в себе никакой информации о порядковых номерах нуклеотидов, по которым произошел разрыв. Однако аналогичные специфические реакции расщепления авторам удалось найти и для трех остальных нуклеотидов. Они смогли получить соответствующие картины разделения отрезков ДНК и для них. Затем они вели электрофоретическое разделение одновременно для всех 4-х случаев в параллельных треках одного геля. Из сопоставления положений всех полос оказалось возможным получить полную информацию о последовательности нуклеотидов в исследуемом фрагменте ДНК. Действительно, все полосы в 4-х треках должны находиться на разных уровнях, потому что длины соответствующих этим полосам отрезков ДНК будут различаться между собой хотя бы на один нуклеотид. Вместе с тем, ничего другого, кроме четырех нуклеотидов, в ДНК нет. Это означает, что совокупность всех отрезков дискретно исчерпывает все возможные удаления от начала молекулы. А следовательно, пронумеровав все полосы в геле, начиная с самой удаленной от старта, совокупно по всем четырем трекам можно получить всю нуклеотидную последовательность секвенируемого фрагмента ДНК.

Ауторадиография — метод регистрации положения радиоактивно-меченых веществ в геле путем фиксации их излучения на рентгеновской пленке. Ведь каждому номеру, оказавшемуся в любом из треков, будет соответствовать заранее известный нуклеотид, определивший место разрыва ДНК при подготовке препарата именно для этого трека.

Отметим, что метод Максама и Гилберта позволяет определить всю последовательность, начиная- с первого нуклеотида. Но представляет немалые трудности в трактовке результатов эксперимента. Ведь он требует уверенного определения чередования полос, находящихся в разных треках. В частности, и таких полос, которые соответствуют отрезкам ДНК длиною в несколько десятков, а то и сотен нуклеотидов с отличием в один нуклеотид. Между тем условия подготовки препаратов, да и самого электрофореза (например, условия теплоотвода) могут быть чуть-чуть разными для разных треков и это может спутать всю картину определения последовательности. Особенно в верхних частях пластины геля, где тесно сдвинуты полосы, соответствующие длинным отрезкам. По этой причине метод Максама и Гилберта не позволял секвенировать фрагменты ДНК крупнее, чем 200-300 нуклеотидных звеньев. Кроме того, он не поддавался автоматизации.

В том же 1977 году (чуть позже) Сенджер и сотр. предложили другой метод секвенирования ДНК. В принципе, он был во многом аналогичен описанному выше методу. Здесь тоже удавалось получить четыре набора отрезков ДНК всех возможных размеров, радиоактивно меченых и заканчивающихся на одном из четырех нуклеотидов. Их точно так же разделяли электрофорезом в 4-х параллельных треках ПААГ, получали четыре «лестницы» полос почернения после ауторадиографии и совокупным анализом последовательности полос в них устанавливали последовательность нуклеотидов в исследуемом фрагменте ДНК. Впрочем, не совсем всю последовательность. Первые несколько нуклеотидов при этом могли остаться не определенными по причине, которая станет ясна из дальнейшего.

Обратимся теперь к тому в чем два метода существенно различались между собой. А именно, к способу получения отрезков ДНК всех возможных размеров, оканчивающихся на любой из 4-х нуклеотидов. Напомню, что Максам и Гилберт радиоактивно метили первый нуклеотид последовательности и химическим способом расщепляли исследуемый однонитевой фрагмент ДНК по всем местам нахождения каждого из нуклеотидов.

Сенджер и сотр. предложили использовать тот же однонитевой фрагмент ДНК в качестве матрицы для комплементарного синтеза по ней с помощью ДНК-полимеразы I множества неполных копий всех возможных размеров, оканчивающихся на определенном нуклеотиде. Для этого избранный нукле-отид должен был быть модифицирован таким образом, чтобы «не потеряв своего лица» быть включенным в растущую комплементарную цепь ДНК и ... тем самым прекратить ее рост, фиксируя размер скопированного участка матрицы. Чтобы получить отрезки ДНК всех возможных в этом случае размеров, модифицированный нуклеотид должен быть примешан к смеси четырех нормальных нуклеозидтрифосфатов — предшественников биосинтеза ДНК тоже в виде нуклеозидтрифосфата, но в таком малом количестве, чтобы остановка синтеза при случайном его включении происходила с одинаковой вероятностью в любом месте синтезируемой копии.

Очевидно, что именно с этим модифицированным нуклеотидом следует связать радиоактивную метку, чтобы локализовать определенный им отрезок ДНК на рентгеновской пленке после ауторадиографии. Но что же это за модификация? В какой части нуклеотида она может иметь место? Очевидно, что не в самом нуклеиновом основании. Ведь для того, чтобы быть «узнанным» ДНК-полимеразой и комплементарно включенным в растущую цепь ДНК-копии нуклеотид должен «сохранить свое лицо». Значит модификация должна коснуться дезоксирибозы. Тем более, что именно она участвует в построении сахаро-фосфатной связи между нуклеотидами, то есть в самом процессе наращивания полинуклеотидной цепочки.

Обратимся к рисункам 24, 25 и 26 на стр. 34 и 35. Рассматривая их, нетрудно вспомнить, что связь между соседними нуклеотидами образуется за счет ферментативного отщепления воды от ОН-группы, которой заканчивается остаток фосфорной кислоты в одном нуклеотиде (этот остаток присоединен в 5'-положении «своей» дизоксирибозы) и ОН-группы, присоединенной в 3'-положении к дезоксирибозе его партнера по связи. Между этими двумя положениями и устанавливается фосфорнодиэфирная связь.

Сама дезоксирибоза, как видно из сравнения двух Сахаров на рис. 24, получила свое наименование в связи с тем, что у нее на одну ОН-группу меньше, чем у рибозы. Если для получения нужного нам модифицированного нуклеотида использовать сахар, у которого вместо ОН-группы в 3'-положении стоит просто Н, то такой сахар можно назвать «дидезоксирибозой», и полное название соответствующего ему нуклеотида будет «дидезоксирибонуклеотид». Когда ДНК-полимераза включит в синтезируемую нить ДНК, в соответствии с условием комплементарности, дидезоксирибонуклеотид (а она это сделает «не заметив» подмены), то дальнейшее наращивание нити ДНК-копии прекратится, так как не будет одной из двух ОН-групп, участвующих в образовании сахаро-фосфатной связи.

Описанную процедуру авторы метода сумели повторить и с остальными тремя дидезоксирибонуклеотидами. После чего провели электрофорез продуктов четырех реакций в четырех параллельных треках ПААГ и совокупный анализ результатов разделения как в методе Максама и Гилберта. Первое время оба метода были равноправны. В методе Сенджера и сотр. было то преимущество, что он допускал большую загрузку геля при электрофорезе так как в нем нет невидимых отщепленных «хвостов» ДНК, загружающих полосы меченых отрезков такой же длины. С другой стороны, недостатком метода была необходимость посадки прай-мера на начало копируемой ДНК, от которого только и могла начать работать ДНК-полимераза I. Праймер нетрудно было синтезировать искусственно, но для этого надо было уже знать некоторую начальную последовательность нуклеотидов в секвенируемом фрагменте ДНК. Разумеется, сам праймер входил в состав всех отрезков ДНК, разделенных электрофорезом. Но если он был точно комплементарен началу матрицы, то это не мешало ее полному секвенированию. Само секвенирование начиналось с первого нуклеотида после праймера. Заметим на всякий случай, что выяснив последовательность нуклеотидов в синтезируемой нити ДНК мы узнаем, в силу комплементарности, последовательность и в самой исходной нити ДНК.


Случайные файлы

Файл
157114.rtf
82784.rtf
18847-1.rtf
~1.DOC
145251.rtf




Чтобы не видеть здесь видео-рекламу достаточно стать зарегистрированным пользователем.
Чтобы не видеть никакую рекламу на сайте, нужно стать VIP-пользователем.
Это можно сделать совершенно бесплатно. Читайте подробности тут.