Ионообменная хроматография (11030)

Посмотреть архив целиком











Реферат на тему:


ИОНООБМЕННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ



Подвижная и неподвижная фазы


Переходя к рассмотрению вариантов истинной хроматографии, полезно ввести понятия «подвижной» и «неподвижной» фаз. Имеется в виду движение фракционируемых молекул вниз по колонке. Подвижную фазу, естественно, составляют молекулы, находящиеся вне гранул. Они движутся вместе с током элюента. Неподвижную фазу — молекулы, находящиеся внутри гранул. Такое разделение имело место и при гель-фильтрации. Там неподвижные в указанном смысле молекулы были таковыми в силу их растворения в неподвижной водной среде, заполнявшей гранулы. Конечно, и в этой среде они совершали броуновское движение, но это не подвигало их к выходу из колонки. С материалом самих гранул они если и взаимодействовали, то чисто механически — наталкиваясь на нити полимера, образующего гранулы.

В случае ионообменной хроматографии, наоборот, неподвижную фазу, в основном, составляют молекулы определенным образом связанные с материалом гранул («сорбированные» на нем). Пористость последних в этом случае выбирают так, чтобы фракционируемые молекулы могли бы практически беспрепятственно проникать в гранулы, заполняя весь их внутренний объем.

Само название ионообменная хроматография указывает на то, что связь молекул с гранулами должна быть ионная. То есть определяться кулоновскими силами притяжения между ионами противоположных знаков, закрепленными на нитях гранул и существующими на поверхности молекул. Слова «закрепленные» и «существующие» наводят на мысль о раз и навсегда фиксированной ситуации. Между тем, гибкость и эффективность метода ионообменной хроматографии опирается как раз на возможность управления этой ситуацией, а вместе с ней и силой связи молекул фракционируемого вещества с матрицей гранул — характером сорбции этих молекул.



Ионогенные группы


Вместо неизменных ионов на нитях матрицы и на поверхностях макромолекул (например белков) располагаются «ионогенные группы», которые в зависимости от условий в окружающей их водной среде (рН, наличие солей) могут проявлять себя либо как открытые, несущие электрический заряд ионы, либо быть нейтрализованными за счет сближения с ними несущих противоположный заряд ионов, например Na+ или С1-, а иногда за счет диссоциации или присоединения протонов Н+.

На поверхности белков ионогенными группами заканчиваются боковые ветви таких аминокислот, как лизин и аргинин или аспарагиновая и глутаминовая кислоты. Диссоциация протона в первом случае и ассоциация во втором нейтрализуют эти группы. Оба эти процесса зависят от концентрации протонов в окружающей водной среде, т. е. от величины рН (соответственно в щелочной или кислой области). Вместо химической модификации, каковой являются оба названных явления, нейтрализация заряда ионогенной группы может происходить и за счет его экранизации противоположно заряженным ионом, подходящим под действием кулоновской силы вплотную к ионогенной группе из окружающей среды. Ковалентной химической связи не образуется. Экранирующий ион в этом случае именуется «контрионом».

Ионогенные группы, способные проявлять свой положительный заряд, именуются «анионитами» — они в какой-то мере подобны аноду в электрической цепи. Группы, открывающие свой отрицательный заряд, соответственно именуются «катионитами». Для модификации нитей хроматографических гранул практика отобрала небольшое число ионогенных групп различной «силы». Наиболее употребимыми для «анионообменников» (хроматографических матриц, несущих аниониты) являются: диэтилами-ноэтил — сокращенное обозначение ДЕАЕ и ди-этил-2-оксипропиламиноэтил сокращенное обозначение QAE. Заметим, что первая из этих групп сравнительно легко может нейтрализоваться химически в щелочной среде за счет потери протона. Вторая — несет положительный заряд при любом значении рН среды и может нейтрализоваться только экранизацией отрицательно заряженным контрионом. В соответствии с этим отличием анионообменники на основе ДЕАЕ именуются «слабыми», а обменники на основе QAE — «сильными».

Аналогично и в случае отрицательных ионогенных групп, «катионообменники» бывают «слабыми» — они несут карбоксиметильные группы и «сильными», которые модифицированы сульфопропильными группами. Сокращенные обозначения этих групп, соответственно, СМ и SP. Сильные катионообменники сохраняют свой отрицательный заряд во всем рабочем биологическом диапазоне значений (рНЗ—11) и могут быть только заэкранированы положительными контрионами.

Что же касается матриц, несущих описанные модификации (в случае фракционирования биополимеров), то это уже знакомые нам гранулы на основе полисахаридов: сефадексы, химически сшитые агарозы и целлюлозы. В их торговых наименованиях присутствуют и название материала матрицы и сокращенного указания ионогенной группы. Например: «ДЕАЕ-сефадекс», «QAE-целлюлоза», «СМ-сефадекс», «SP-сефароза CL» и т. д. В каждом типе предлагается несколько обменников, различающихся между собой размерами гранул и пор.

Матрицы для ионообменной хроматографии при высоком давлении (на основе силикагеля) я оставляю в стороне. Фирма Pharmacia для своей системы быстрой хроматографии белков разработала на основе исключительно однородных по размерам гранул два типа сильных ионообменников: анионообменник под торговым названием «Моно Ф» — активная группа триметиламинометил и катионообменик «Моно S» — активная группа сульфометил .

Теперь полезно будет представить себе некоторые пространственные соотношения. Будем ориентироваться на очистку и фракционирование белков, поскольку это — основная область использования ионообменной хроматографии. Диаметры глобулярных белков (в отличие от их масс) варьируют не очень сильно. Так например, молекула бычьего сывороточного альбумина (М = 69 000) имеет в поперечнике 70 А, а молекула гамма-глобулина (М =150 000) около 100 А. (Ввиду этих цифр я не упоминал матрицы на основе полистирола, поскольку у них размер пор лежит в пределах 5-20 А.)

Пористость матриц, используемых для фракционирования белков, лежит в диапазоне 300-1000 А. В таких порах молекулы белков могут перемещаться столь же свободно, как теннисный мячик в изготовленной из проволоки пространственной сетке с ребром ячейки в 30-40 см.

На поверхности белков могут находиться ионогенные группы аминокислот обоих знаков (все — слабые), отстоящие друг от друга на расстоянии в несколько десятков ангстремов. Ионогенные группы внутри гранул могли бы располагаться теснее, поскольку присоединение по ОН-группам могло бы осуществляться в каждом звене глюкозы. Но это бесполезно, так как с двумя столь близко расположенными группами не смогли бы в силу своих размеров взаимодействовать одновременно две молекулы белка, и невыгодно, поскольку чревато слишком прочным связыванием одной молекулы в нескольких точках. Практика выработала для среднего расстояния между ионогенными группами на одной матрице величину в 10—30 А.


Ионы и контрионы


Еще следует напомнить, что в жидкости, заполняющей поры ионообменника, обязательно присутствуют контрионы. Во-первых, от самого ионообменника, который поступает в распоряжение экспериментатора всегда в нейтральной форме, то есть вместе с контрионами (Na+, K+ или С1- формы). Во-вторых, это контрионы ионогенных групп белков и, наконец, это ионы, присутствующие в элюенте по воле исследователя.

Контрионы, благодаря электростатистическому притяжению, находятся вблизи соответствующих ионов, но не связаны с ними химической связью. Поэтому под воздействием тепловых ударов молекул воды легкие контрионы часто отходят от ионогенных групп на значительные расстояния, а иногда и вовсе отрываются от них (кулоновские силы с расстоянием убывают очень быстро). Но очень скоро эти контрионы либо возвращаются, либо заменяются другими, точно такими же. Когда контрион находится вблизи иона ионогенной группы, он нейтрализует (экранирует) поле его заряда, когда удаляется — для электрического поля иона открывается возможность взаимодействовать с другими ионами, в том числе с ионами, открывшимися на поверхности оказавшейся вблизи молекулы белка.

Если бы обнажение заряда на матрице сопровождалось свечением, а сами мы, превратившись в «супергномов», оказались внутри гранулы ионообменника, то нашим глазам представилась бы волшебная картина мерцания бесчисленного множества разбросанных по всему объему огоньков. (Допустим, что красных, если заряды положительные.) Чем выше концентрация соли в элюенте, тем меньше времени каждый из зарядов ионообменника оставался бы открытым и, соответственно, меньшее число их было бы открыто одновременно — красные вспышки света стали бы короче и число огоньков уменьшилось. Если ионообменник слабый, то общее число ионогенных групп матрицы, участвующих в этом «фейерверке», можно было бы регулировать изменениями рН элюента, нейтрализуя химически часть ионогенных групп.

Теперь дополним нашу воображаемую картину медленно плывущими внутри гранулы крупными молекулами белка. На них тоже вспыхивают огоньки. Но уже двух цветов: красные и синие, так как кроме положительных анионитов на поверхности белка имеются и отрицательные ионогенные группы — катиони-ты. Разумеется для них тоже найдутся контрионы. При изменениях рН среды будет увеличиваться интенсивность свечения одних слабых ионогенных групп белка и одновременно уменьшаться интенсивность свечения других (другого цвета). Ионы соли, находящиеся в элюенте, влияют на электрическую активность незаблокированных за счет рН ионогенных групп белка в соответствии со своими зарядами.


Случайные файлы

Файл
55493.rtf
SRFTA .doc
20495-1.rtf
124924.rtf
27362.rtf




Чтобы не видеть здесь видео-рекламу достаточно стать зарегистрированным пользователем.
Чтобы не видеть никакую рекламу на сайте, нужно стать VIP-пользователем.
Это можно сделать совершенно бесплатно. Читайте подробности тут.