Регистрация сигнальных молекул (9763)

Посмотреть архив целиком

содержание



стр.

Список сокращений


введение


1. обзор литературы


1.1. Использование Ti-плазмид агробактерий в генетической инженерии


1.1.1. Краткая характеристика Agrobacterium tumefaciens


1.1.2. Cоздание векторов на основе Ti-плазмид


1.1.3. Процессинг тДНК в бактериальной клетке

и ее перенос в клетки растений


1.1.4. Разработка система трансформаций растений с

помощью Agrobacterium tumefaciens


1.1.5. Проблема сохранения чужеродных генов,

перенесенных в растение


1.1.6. Анализ экспрессии чужеродных генов в трансформированных растениях


1.2. Использование метода генетической

инженерии для трансформации однодольных растений


1.2.1. Краткие характеристики ряски


1.3. Сигнальные молекулы, их способность индуцировать процессинг тДНК


2. Материалы и методы


2.1. Материалы


2.1.1. Оборудование


2.1.2. Бактериальные штаммы и плазмиды


2.1.3. Растения


2.1.4. Среды микробиологические для

культивирования растений


2.1.5. Другие растворы


2.1.6. Ферменты, используемые в генной инженерии


2.1.7. Антибиотики


2.2. Методы


2.2.1. Инкубация Agrobacterium tumefaciens с

экссудатами тканей растений


2.2.2. Выделение тотальной ДНК Agrobacterium tumefaciens


2.2.3. Блод-гибридизация тДНК по Саузерну


2.2.4. Трансформация клеток Esherichia coli


3. результаты


4. обсуждение


5. выводы


литературы


приложение


СПИСОК СОкРАЩЕНИЙ


НУК – нафтиуксусная кислота

БАП – бензиламинопурин

MS –

LB –

тДНК –

Ар – ампицилин

Cs – цефотоксин

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы:

Свойство бактерий вида Agrobacterium tumefaciens вызывать у растений корончато-галловую болезнь связано с присутствием в их клетках крупных (95-156 мДа) конъюгированных Ti-плазмид (от англ. tumor-inducing – вызывающий опухоль). В процессе идентифицирования растений часть генетического материала Ti-плазмид – тДНК (от англ. transferred DNA – передаваемая) перемещается в растительные клетки и интегрируется в хромосомы, оставаясь частью наследственного материала. Гены тДНК экспрессируются в трансформарованных растительных клетках, нарушают их фитогормональный баланс и определяют синтез специфических ------- соединений.

Таким образом, агробактерии являются природными "генными инженерами", осуществляющий поразительный по филогенетической дальности перенос генетической информации. На основе агробактерий сконструированы эффективные векторные системы для генетической инженерии растений.

Агробактириальная трансформация происходит в результате сложного процесса взаимодействия между бактериальными и растительными клетками. В этом процессе одной из решающих стадий является рецепция агробактериями особых сигнальных молекул, присутствующих в экссудатах поврежденных тканей растений. Сигнальные молекулы индуцируют экспрессию генов области vir (агробактериальных Ti-плазмид), контролирующих вырезание тДНК и ее перенос в клетки растений. Агробактерильная трансформация наблюдается у широкого круга голосеменных и двудольных растений, однако, она отмечена лишь у весьма незначительного числа однодольных растений. Одной из причин ограничений агробактериальной трансформации однодольных считается присутствие в их клетках сигнальных молекул, индуцирующих процессинг и перенос тДНК.

Цель работы:

В настоящее время имеются противоречивые данные относительно наличия таких сигнальных молекул у однодольных растений. В связи с этим, целью данной работы был анализ ряски на присутствие у них сигнальных молекул, индуцирующих процессинг тДНК.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Использование Ti-плазмид агробактерий в генетической инженерии растений

1.1.1. Краткая характеристика Agrobacterium tumefaciens


За последнее десятилетие в области генетической инженерии растений достигнуты значительные успехи. Были разработаны разнообразные методы генетической трансформации и, в настоящее время осуществлена экспрессия чужеродных генов в растениях многих видов. Наиболее важным для развития генетической инженерии растений было открытие молекулярных основ опухолевых образований с помощью Agrobacterium tumefaciens [7].

Вирулентные штаммы Agrobacterium tumefaciens (сем. Rirobiaceae) характеризуются присутствием в клетках большой плазмиды, так называемой Ti-плазмиды, весом более 150 т.п.н. (см. Приложение) [9].

Агробактерии вызывают опухолевый рост у многих двудольных и голосеменных, а так же у некоторых однодольных растений [2,3]. Для инфицирования in vivo необходимо повреждение тканей растения [12].

После прикрепления к клеточной стенке растительной клетки агробактерии переносят часть Ti-плазмиды (так называемой тДНК) в ядро, где происходит ее стабильная интеграция в хромосому растения.

Доказано, что функция распознавания клеток и прикрепления к ним, а так же вырезание, перенос и, возможно, интеграция тДНК в растительный геном кодируется двумя хромосомными генами – Chva и Chvb [13] и рядом генов vir-области, находящихся на Ti-плазмиде [14].

После переноса в ядро растительной клетки, тДНК может интегрировать в геном в виде одной или нескольких копий [15]. Встроенная тДНК имеет свойства, характерные для ДНК эукариот, что показано в экспериментах по гиперчувствительности к ДНК-азе I (Schafer, 1984). В зависимости от типа Ti-плазмиды, в тДНК находится от семи до тринадцати генов, ответственных за опухолевый фенотип. Гены 1 и 2 кодируют ферменты, участвующие в синтезе ауксина, индолилуксусной кислоты, в то время, как ген 4 кодирует изопентенилтрансферазу, синтезирующую цитокинин изопентенила денозин 5'-монофосфат [16].

Одновременная транскрипция генов 1,2 и 4 приводит к повышению уровня фитогормонов внутри трансформированных клеток. Результатом этого является повышение митотической активности и образование опухоли. Другие гены тДНК кодируют синтез так называемых опинов, из которых наиболее изучены нопапин и октопин. Опины представляет собой производное аминокислот и сахаров, которые служат источником питания для агробактерий [14]. В целом, образование корончатого галла представляет собой хорошо охарактеризованный пример генетической инженерии растений в природе.

Мутации в вирулентных генах агробактерий. Наличие Ti-плазмид в клетках агробактерий является абсолютно необходимым условием патогенности микроорганизма. Излеченные от Ti-плазмид штаммы агробактерий авирулентны. На вирулентность Agrobacterium tumefaciens оказывают влияние различные мутации, картируемые как на опухолевых плазмидах, так и на хромосомах. Ранние этапы взаимодействия агробактерий с растениями, так же как хемотаксис, прикрепление к поверхности растительной клетки и специфическое связывание в центрах инфекции контролируются генами, имеющими хромосомную локализацию. В хромосоме расположены некоторые гены, регулирующие экспрессию vir-генов Ti-плазмид [19]. Присоединение агробактерий к клеткам растения является одним из первых этапов, определяющих эффективное взаимодействие. Этот этап у Agrobacterium tumefaciens контролируют два связанных между собой хромосомных локуса Chva и Chvb, размерами 1,5 kb и 5kb, соответственно [Дуглас и др, 1985]. Гены этих локусов экспрессируются конститутивно. В результате транспозонного мутагенеза этих областей получают авирулентные или дефекнтые по прикреплению агробактерии. Мутации в этих локусах сильно понижают или ингибируют вирулентность бактерии, но не для всех хозяев. Локус Chvb определяет синтез нейтрального циклического -D-гликана, который трансформируется в периплазматическое пространство клетки с помощью продукта гена Chva. Роль нейтрального -D-гликана в инфекционном процессе еще точно не установлена. Помимо циклического -D-гликана в прикреплении патогенных агробактерий к растительным клеткам принимают участие и другие полисахариды, в частности внеклеточные экзополисахариды.

Организация vir-генов Ti-плазмид. Вирулентные гены агробактерий на Ti- и Ri-плазмидах кластеризованы в области vir разметом около 30-35 kb, проявляющей в этих плазмидах значительную гомологию ДНК. Выявлена также гомология vir-генов Ti-плазмид Agrobacterium tumefaciens с tra-генами конъюгитивных плазмид. В ----- Ti-плазмидах в области vir локализовано шесть различных групп комплементации A, B, C, D, E и G, организованных в единый регулон [Stachel Nester, 1986]. Октопиновая Ti-плазмида Arh 5 имеет дополнительный локус vir F, расположенный справа от локуса vir E [Kooykaas et al., 1984]. Мутации в генах и --------- vir A, vir G, vir B и vir D придают агробактериям авирулентный фенотип, в отличие от большинства хромосомных мутаций, имеющих круг трансформируемых растений-хозяев.

Продукты генов vir-области контролируют процессинг тДНК в бактериальной клетке, ее перенос в растительную клетку и интеграцию в ядерный геном растения, причем эти процессы гены vir могут определять не только в цис, но и в транс положении по отношению к тДНК (то есть находясь в разных репликонах). Исходя из этого свойства области vir, сконструированы и успешно используются в практике удобные бинарные векторы для генетической инженерии растений [Дрейпер с соавт, 1991]. Для процессов "вырезания" тДНК из плазмиды (точнее, высвобождения в процессе репликативного синтеза) и ее переноса в растение необходимо фланкирование этой области особыми границами: несовершенными прямыми повторяющимися последовательностями ДНК размером 24 ---- , проявляющими значительную гомологию у всех изученных Ti- и Ri-плазмид. Границы тДНК гомологичны области oriT конъюгативных плазмид. В этой области сайт-специфические эндонуклеазы производят одноцепочечный разрыв, служащий началом репликации по типу разматывающегося рулона, происходящей в процессе транспорта плазмиды. Репликация обеспечивает сохранение плазмиды в материнской клетке и появление ее копии в дочерней.


Случайные файлы

Файл
50946.doc
86083.rtf
538.doc
92551.rtf
90883.rtf




Чтобы не видеть здесь видео-рекламу достаточно стать зарегистрированным пользователем.
Чтобы не видеть никакую рекламу на сайте, нужно стать VIP-пользователем.
Это можно сделать совершенно бесплатно. Читайте подробности тут.