Влияние гипотермии на экспрессию генов (11399)

Посмотреть архив целиком











Влияние гипотермии на экспрессию генов



Введение


Количественные и качественные преобразования белков растений при снижении температуры предполагают индукцию или репрессию их синтеза. Необходимые доказательства правомерности такого заключения были получены при изучении отдельных стадий белкового синтеза. Первая из них - транскрипция.



1. Изменения в содержании нуклеиновых кислот при гипотермии


Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что, по сравнению с нормальными условиями, содержание ДНК при гипотермии меняется незначительно. Исследование возможности синтеза нуклеиновых кислот в ядрах клеток скерды волокнистой и триллиума во время охлаждения до температур, близких к 0°С, показало, что в этих условиях идет активное включение меченых соединений. Включение метки становилось значительно интенсивнее при небольшом повышении температуры, либо при увеличении экспозиции. Цитофотометрический анализ содержания ДНК-фуксина в корневой меристеме семян озимых злаков показал, что охлаждение снижает репликативную и метаболитическую активности хроматина. Способность хроматина поддерживать синтез РНК даже в присутствии эндогенного источника РНК-полимеразы заметно подавляется при охлаждении бобов. Возможно, это связано с тем, что при снижении температуры уменьшается доступность матрицы ДНК для полимеразы.

В дальнеших исследованиях было подтверждено положение о том, что содержание ДНК при гипотермии изменяется мало, а все изменения в метаболизме нуклеиновых кислот касаются, в основном, РНК. Показано, что низкотемпературная акклиматизация сопровождается увеличением содержания РНК, расхождения в данных о метаболизме ДНК, по-видимому, зависят от того, вычисляется ли содержание ДНК на единицу сырого или сухого веса. В некоторых случаях отмечаются связанные с гипотермией изменения в содержании транспортных РНК, однако эти изменения наблюдались не всеми авторами. Кроме того, имеются данные об изменении активности тРНК и аминоацил-тРНК-синтетазы во время закаливания растения, что свидетельствует о регуляции в этих условиях синтеза белка на уровне трансляции.



2. Изменения экспрессии генов при гипотермии


Как известно, в клетках растений, насекомых, млекопитающих как тепловой, так и холодовой шок вызывает изменения в активности генов. При этом начинается синтез небольшого числа «белков теплового шока» и прекращается синтез всех остальных белков. Если продолжить аналогию между тепловым и холодовым шоками, то следует ожидать, что при понижении температуры в определенных границах начнут функционировать специфические гены. В этой связи становится понятной противоречивость данных об изменении содержания РНК при гипотермии. Значительная часть авторов указывает, что во время охлаждения и холодового закаливания у растени повышается общее содержание РНК, но имеются и противоположные результаты. Изучение специфических видов РНК после фракционирования показало относительное повышение содержания РНК, действующе на уровне трансляции. Низкотемпературное закаливание растения приводит к структурным изменениям в рибосомах.

Ч. Гай с соавторами привели прямое доказательство того, что гипотермия индуцирует изменения в экспрессии генов. Используя трансляцию в бесклеточно системе, они показали, что под действием низких положительных температур происходит быстрое и стабильное изменение набора поли+мРНК, выражающееся в появлении специфических РНК холодового стресса. Изменение набора поли+мРНК происходило уже в первые сутки закаливания, при этом начиналось развитие холодоусточивости,. С началом развития устойчивости коррелировало появление двух мРНК, которые в бесклеточно системе определяют синтез белков холодового шока с молекулярными массами 82 и 180 кДа. В последующие 8 суток продолжается изменение состава мРНК: содержание четырех мРНК увеличивается, а трех - значительно уменьшается. Большая часть белков, синтез которых индуцировался гипотермие, не идентична по молекулярным массам и pI белкам теплового шока. Таким образом, это сообщение является одним из первых свидетельств существования в растениях белков холодового шока, отличных от белков теплового шока.

Быстрое изменение набора мРНК с началом холодового закаливания было впоследствии подтверждено другими исследователями. Так, было показано, что двухдневная экспозиция проростков люцерны при 40С приводит к резкому увеличению содержания общего количества РНК и к изменению состава транслируемых мРНК. Трансляция in vitro поли+мРНК, с последующим электрофорезом меченых полипептидов, показала индукцию синтеза низко- и высокомолекулярных белков холодового шока. При переносе растений в условия с «нормальной» температурой происходило обратное изменение спектра полипептидов и, следовательно, набора мРНК. Показано, что мРНК, индуцируемые охлаждением, накапливаются с различно скоростью. При трансляции in vitro обнаружены группы белков с различной индукцией синтеза de novo -от 6 до 12 часов, а также белки, содержание которых при холодовом закаливании снижается.

В последующие годы изучение изменений в синтезе РНК при низкотемпературном стрессе привлекло особое внимание исследователе. К настоящему времени выделено и охарактеризовано значительное число мРНК, экспрессирующихся при низкотемпературном стрессе и в процессе адаптации растения к низким температурам. В частности, установлено, что, например, в люцерне во время холодовой акклиматизации накапливаются две мРНК, MsaCiA и MsaCiB, которые кодируют белки, содержащие богатые глицином мотивы. Слитые полипептиды, содержащие аминокислотные последовательности, выведенные на основании этих мРНК, продуцировались в E. coli и были использованы для получения антител. Полученные антитела обладали кросс-реактивно специфичностью с растворимыми полипептидами MsaCiA и MsaCiB, соответственно. Эти полипептиды обнаруживались только в верхушках закаленных растений, хотя во время холодовой акклиматизации мРНК для

MsaCiA накапливалась как в верхушках, так и в стеблях. Анализ белков при помощи вестерн-блоттинга показал, что MsaCiA-подобные белки с молекулярными массами 32, 41 и 68 кДа накапливались в клеточных стенках стебле, и один, с молекулярно массой 59 кДа, - в клеточных стенках побегов. Показано, что эта дифференциальная экспрессия включает как транскрипционную, так и посттрансляционную регуляцию. Сравнение, проведенное между шестью сортами люцерны с контрастно морозоустойчивостью, подтверждает то, что способность накапливать до значительного уровня белки, подобные MsaCiA и MsaCiB, может быть связана с устойчивостью растения к низким температурам.

В ходе исследований экспрессии генов при низких температурах было выявлено несколько групп генов, экспрессия которых индуцируется холодовым шоком и адаптацией растения к низким температурам. Далее будут рассмотрены основные семейства таких генов.


3. Семейство генов Wcs 120


Озимые, по сравнению с яровыми злаками, обладают эффективными механизмами акклиматизации, которые позволяют им перезимовывать и выживать при температуре замерзания почвы. Это различие генетически запрограммировано и включает в себя сложную генетическую систему. Чтобы понять характер данной системы и ее регуляцию низкими температурами, были идентифицированы и охарактеризованы гены пшеницы, устойчивой к замерзанию почвы. В ходе этих исследований установлено, что семейство гена wcs120 кодирует группу белков с молекулярными массами от 12 до 200 кД. Как показано при помощи биохимических, иммуногистохимических и молекулярно-генетических анализов, данное семейство генов, специфическое у Poaceae, весьма многочисленно и координированной регулируется низкими температурами. Более того, накопление белков WCS прямо коррелирует с уровнем устойчивости растений к замерзанию почвы. Эти анализы обнаружили также регуляторны контроль процесса яровизации при экспрессии генов низкой температуры у озимых злаков.

Индуцируемые низко температурой у пшеницы гены семейства wcs120 были картированый с использованием вестерн- и Саузерн-блоттинга на дителоцентрических сериях сорта Chines Spring. Идентифицированные гены были локализованы в длинных участках гомологичных групп 6-х хромосом всех трех геномов гексаплоидной пшеницы. Близкие виды, также несущие A, АВ или D геномы также исследовались с использованием вестерн- и Саузерн-блоттинга с wcs120- зондами и WCS120- антителами. Все близкородственные виды несли один или более геномов гексаплоидной пшеницы и продуцировали 50 кДа белок, реагирующи с антителами и определяемы при помощи вестерн-блоттинга, и wcs120-гомологи, которые определялись при помощи Саузерн-блоттинга во всех видах. Отсутствие участка 6DL хромосомы в гексаплоидной пшенице сорта Chines Spring вызывало отсутствие синтеза 50 кДа белка, что не только указывало на локализацию wcs120 в данном участке 6DL-хромосомы, но также и подтвердило молчание wcs120-гомологов в 6А хромосоме. Были также исследованы содержание белков, реагирующих с антителами на WCS120, и уровни холодоустойчивости в сериях лини с заменой хромосом сорта Chines Spring на хромосомы сорта Cheyenne. В ходе экспериментов было установлено, что 5А хромосома сорта Cheyenne увеличивала холодоустойчивость пшеницы сорта Chines Spring. Денситометрия вестерн-блоттингов для определения содержания белка показала, что хромосома 5А имеет регуляторный эффект на экспрессию гена семейства wcs120, располагающегося на хромосомах 6-о группы всех трех геномов гексаплоидной пшеницы.


Случайные файлы

Файл
142708.rtf
94599.rtf
112406.rtf
60026.rtf
19293.rtf




Чтобы не видеть здесь видео-рекламу достаточно стать зарегистрированным пользователем.
Чтобы не видеть никакую рекламу на сайте, нужно стать VIP-пользователем.
Это можно сделать совершенно бесплатно. Читайте подробности тут.