Изучение радиологических эффектов у высших растений, обитающих на территории Восточно-Уральского радиоактивного следа (10983)

Посмотреть архив целиком

Оглавление


Введение

1 Обзор литературных данных

2 Материал и методика исследования

3 Результаты и обсуждение

3.1 Цитогенетические исследования

3.1.1 Спонтанный мутагенез

3.1.2 Влияние неравномерного фракционированного облучения на прозанник пятнистый (Achyrophorus maculatus L.)

3.1.2.1 Влияние на индуцированный мутагенез γ-лучей 60Со в дозе 5 Гр

3.1.2.2 Влияние на индуцированный мутагенез γ-лучей 60Со в дозе 30 Гр

3.1.2.3 Значение временной организации фракционированного облучения в формировании радиологического эффекта

3.2 Биохимические исследования

Заключение

Список использованной литературы

Приложения



Введение


29 сентября 1957 года вследствие теплового взрыва емкости с радиоактивными отходами на Южном Урале (химкомбинат «Маяк») произошла одна из наиболее крупных ядерных аварий. Суммарный выброс радионуклидов был равен 7,4×1016 БкI. Исключительно важное радиологическое значение имело присутствие в составе смеси долгоживущего радионуклида – 90Sr с периодом полураспада 28,5 лет, что и предопределило длительную опасность этого радиоактивного загрязнения [5]. В результате указанного выброса образовался ВУРСII – уникальный полигон для изучения эффектов хронического облучения малыми дозами [7].

Изучение механизмов радиорезистентности природных популяций региона Кыштымской аварии вносит вклад в разработку проблемы накопления патологического груза, механизмов адаптации к радиационной среде, прогнозирования отдаленных последствий и поиску средств их коррекции [16]. Актуальность этой проблемы определяется тем, что на ясном понимании закономерностей формирования биологических эффектов малых доз ионизирующего излучения должна основываться разработка новой концепции радиационной защиты человека и биоты [8].

В плане выяснения природы явлений, наблюдающихся при фракционировании дозы, значительный интерес представляют работы с описанием защиты от радиации под действием предварительного облучения малой дозой. Радиация обладает многосторонним действием на клетку и организм и наложение двух доз отражается неодинаково на отдельных составляющих радиационного эффекта, влияя на выход цитогенетических нарушений [12].

Целями настоящей работы на высших растениях с территории ВУРСа являются:

  • изучение влияния малых доз ионизирующих излучений на спонтанный мутагенез;

  • межвидовые сравнения хромосомной нестабильности;

  • исследование эффекта неравномерного фракционированного облучения;

  • определение роли антиоксидантных систем в формировании радиопротекторного эффекта.

Для достижения целей необходимо выполнение следующих задач:

  1. ознакомление с объектами исследования и условиями их обитания;

  2. анализ состояния проблем на сегодняшний день;

  3. освоение методик исследований и применение их на практике;

  4. применение методов вариационной статистики для обработки и анализа эмпирических данных.



1 Обзор литературных данных


Изучение мутационного процесса в природных популяциях, подвергающихся хроническому действию ионизирующих излучений, важно в связи c задачами, возникающими в теории эволюции, с разработкой проблем охраны окружающей среды, для прогнозирования отдаленных генетических последствий загрязнения биосферы радионуклидами [4].

Среди классических методов радиобиологии и радиационной генетики наибольший интерес представляет прием повторного действия мутагенов. При взаимодействии эффектов двух доз возможно модифицирующее влияние предыдущего облучения на результат последующего. Фракционирование дозы облучения является методом анализа процессов восстановления [12, 25], кроме того, оно неодинаково отражается на отдельных составляющих радиационного эффекта. При повторном облучении в определенных условиях возникает эффект защиты, который наиболее легко обнаружить при использовании первого облучения в небольшой дозе [12]. Считается, что хроническое облучение является частным случаем фракционирования дозы [25].

Решающим фактором в ответной реакции клетки является доза. Клетка обладает способностью устранить нанесенное ей повреждение. Помимо суммарной дозы на ход реакции восстановления влияет и мощность доз. Как правило, при уменьшении мощности доз, т.е. при растягивании времени облучения, процесс восстановления выражен сильнее, а лучевое поражение меньше [11].

Многие авторы указывают на повреждающее действие повышенного фона радиоактивности, однако положительное действие малых доз радиации также широко известно: стимуляция биологических процессов: роста, развития, выживаемости, плодовитости, исцеления и др. [12, 21]. В популяциях дикорастущих растений, произрастающих на загрязненных радионуклидами территориях, произошли адаптационные изменения, выражающиеся в повышенной радиоустойчивости по сравнению с популяциями тех же видов, произрастающими на чистых незагрязненных почвах [3, 4, 17, 24]. Одним из механизмов повышения радиоустойчивости облучаемых организмов является увеличенное содержание в их тканях антиоксидантов [17]. Однако мутационный процесс в облучаемых популяциях растений протекает более интенсивно по сравнению с контрольными [4, 24].

Сравнение биохимических показателей у двух видов мелких млекопитающих, обитающих на контрольных и радиационно-загрязненных территориях ВУРСа позволило отнести характеристики окислительно-восстановительного метаболизма к основным физиологическим детерминантами (определителями) их радиорезистентности к длительному низкоинтенсивному воздействию [16].

Приступая к экспериментам с предварительным облучением малой дозой, авторы [13] предполагали, что данное воздействие может вызвать скрытые лучевые повреждения, снижающие выживаемость объекта после дополнительного облучения массивной дозой, однако их предположения не подтвердились. Снижение частоты хромосомных аберраций при фракционировании дозы связано с обратимыми физиологическими изменениями в клетке, которые делают хромосомы менее чувствительными ко второй экспозиции [1]. Авторами [13] высказывается предположение, что радиобиологические эффекты радиостимуляции и повышения радиорезистентности под влиянием предварительного облучения малыми дозами регулируются единым механизмом.

В основе радиационно-химических изменений молекул могут лежать два механизма. 1. Прямое действие, при котором данная молекула испытывает изменение непосредственно при прохождении через нее кванта энергии. 2. Косвенное действие – изменяемая молекула непосредственно не поглощает энергию падающего излучения, а получает ее путем передачи от другой молекулы [9, 25].

Ионизирующие излучения характеризуются незадержанным эффектом индуцирования аберраций хромосом [12], что позволяет использовать в качестве количественного показателя радиочувствительности подсчет клеток с хромосомными перестройками. Оценка поражения может проводиться путем мета- или анафазного анализа, но первый из них весьма трудоемок. При анализе анафаз легко различимы «летальные» для клетки аберрации – дицентрики и фрагменты; достоинством этого метода является относительная простота, делающая его доступным и в то же время достаточно корректным для оценки радиочувствительности [25]. Часть аберраций, как, например, дицентрики, механически препятствует делению клетки; появление ацентрических фрагментов приводит к неравномерному разделению и утрате генетического материала, вызывающего гибель клетки из-за нехватки метаболитов, синтез которых кодировался ДНК утраченной части хромосомы [11, 25]. Учет частоты фрагментов, однако, не является достаточно надежным показателем вследствие того, что фрагменты могут вовлекаться расходящимися хромосомами в анафазные шапки, где они не обнаруживаются, после чего элиминируются, объединяясь в микроядра; к тому же, фрагменты могут теряться в процессе приготовления препаратов [12, 25].

Структурно-метаболическая теория (СМТ) в радиобиологии является современным обобщением огромного фактического материала и ранее существовавших теорий в радиобиологии в свете представлений о неразрывном единстве и взаимовлиянии структуры и метаболизма. СМТ исходит из положения, что при действии радиации на клетку первичные процессы возникают во всех ее структурах и затрагивают многие метаболические процессы, неразрывно связанные с этими структурами. Любой радиобиологический эффект возникает во времени в результате взаимодействия многих процессов, как развившихся после облучения, так и нормально протекающих в клетке. СМТ подчеркивает значение фактора времени в проявлении любых радиобиологических эффектов. Скорость протекания процессов, происходящих в клетке после облучения, будет зависеть не только от места и величины поглощенной энергии, наличия веществ, обрывающих цепные процессы. Структурно-метаболическая теория рассматривает механизмы поражающего действия сублетальных и летальных доз радиации, так и стимулирующего действия малых доз радиации. СМТ является общей теорией действия радиации на биологические объекты, начиная с клеточного уровня и заканчивая высокоорганизованными многоклеточными организмами [9].



2 Материал и методика исследования


Объектами исследования являются многолетние травянистые растенияIII: Прозанник пятнистый – Achyrophorus maculatus L. (семейство Сложноцветные; 2n = 10, рис. 1А; стр. I) и два вида подорожника: Подорожник ланцетолистный – Plantago lanceolata L. (2n = 12, рис. 1Б) и Подорожник средний – Plantago media L. (2n = 24, рис. 1В, оба из семейства Подорожниковые) [13]. Семена всех видов растений были собраны на территории Восточно-Уральского радиоактивного следа как с контрольных участков, так и с загрязнённых радионуклидами 90Sr–90Y и 137Cs. В местах сбора материала первоначальное загрязнение составляло 1500-2000 КиIV/км2; 90% дозы формируется за счёт распада 90Sr и 10% – за счёт 137Cs. В настоящее время прошло 1,7 периодов полураспада радиостронция и остаточное загрязнение составляет 525 Ки/км2 (интенсивность γ-излучения 0,8 рад/сутки) (рис. 2; стр. II) [15].

Реагенты: раствор гидроперита (0,0025 М), раствор крахмала (0,125% по массе), раствор йода (0,0125% по массе).

Оценка уровня спонтанного мутагенеза проводилась на всех указанных видах, эффекты фракционированного облучения – на A. maculatus, биохимические исследования – на двух видах подорожника.

Семена A. maculatus провокационно облучались γ-лучами 60Co при мощности дозы 219 рад/минV. Применялось неравномерное фракционированное облучение (начальная доза 5 ГрVI; разрешающая доза 30 Гр) с интервалами между фракциями 1 час или 1 сутки. Изучались варианты: без облучения, с облучением в малой дозе (5 Гр), с облучением в массивной дозе (30 Гр), а также варианты с различной временной организацией облучения (сочетание 5 Гр + 30 Гр).

Исследуемые семена проращивались, и фиксировались проростки по достижении длины корешка в 4-5 мм для прозанника и 2-3 мм для подорожников в смеси этанола и «ледяной» уксусной кислоты в компонентном отношении 3:1. Учитывались частоты хромосомных аберраций в ана-телофазе митоза в клетках корешков, для чего растения окрашивали ацетокармином в течение 5-15 минут на водяной бане. Давленые временные микропрепараты изготовлялись из кончика корешка длиной около 2 мм. Наблюдения производили при 600-кратном увеличении с водной иммерсией, используя зеленый фильтр. В каждом варианте просчитывалось в среднем по 500 ана-телофаз.

Микропрепараты фотографировались по авторской методике без применения аналогового цифрового преобразователя при 900-кратном увеличении с масляной иммерсией с помощью цифрового фотоаппарата мобильного телефона LG B2100 (рис. 3; стр. III, IV).

Биохимические исследования проводились на P. lanceolata и P. media методом йодометрии (титрование), в основе которого лежит реакция [6, 22]: 5H2O2 + I2 = 4H2O + 2HIO3.

Отобранные для анализа растения, тщательно очищенные от земли и обсушенные фильтровальной бумагой до постоянного веса, взвешивались и растирались со стеклянным порошком в фарфоровой ступке. Полученная смесь разводилась дистиллированной водой в расчете 9 мл воды на каждые 100 мг растения и центрифугировалась на ручной центрифуге в течение 5 минут при скорости вращения 1200 об/мин.

В раствор гидроперита, объёмом 5 мл, добавлялись 0,2 мл надосадочной жидкости, и смесь выдерживалась в течение 30 секунд, после чего приливались 3 мл раствора крахмала в качестве индикатора. Смесь титровалась йодом до получения эталонной голубой окраски, сохраняющейся в течение 3 секунд, после чего регистрировался объём затраченного йода.

Для статистической обработки данных использовались следующие методы: дисперсионный анализ двухфакторных неравномерных комплексов для качественных признаков; дисперсионный анализ однофакторных комплексов для качественных признаков; критерий χ²; точный критерий Фишера (F); критерий Стьюдента (td); критерий «ФИ» (Fφ). Для данной обработки в таблицах Excel автором работы были созданы алгоритмы вычисления необходимых показателей с использованием литературы [14, 23].



3 Результаты и обсуждение


3.1 Цитогенетические исследования


Результаты данных исследований позволяют выявить зависимость изменения радиочувствительности высших растений как минимум от трех факторов: хронического β-, γ-облучения; числа хромосом в кариотипе (плоидности); предварительного γ-облучения при неравномерном фракционировании дозы. Результаты математической обработки данных представлены в таблицах 1, 2 и на рисунках 5-10.


3.1.1 Спонтанный мутагенез

Хроническое облучение вызывает достоверное увеличение частоты аберрантных анафаз в опытных популяциях A. maculatus (p << 0,001) и P. media (p < 0,01), в то же время, в популяциях P. lanceolata отмеченного феномена не наблюдается (p > 0,05), что не противоречит литературным данным [22]. Возрастание частоты аберрантных анафаз связано с ускоренным накоплением мутационного груза [2, 3, 4], так как фон от радионуклидов более чем в 100 раз превышает естественный радиационный фон.

В хронически облучаемых популяциях прозанника по сравнению с контрольными происходит достоверное увеличение частоты дицентриков (χ² = 26,96, ν = ∞, р < 0,001; рис. 6; стр. VI). В эксперименте облучали покоящиеся семена, поэтому двойные разрывы хромосом, приводящие к образованию дицентриков, оставались нереализованными до начала прорастания, когда, вследствие увеличения теплового движения, обломки хромосом смещаются, образуя разнообразные транслокации (рис. 3-4; стр. IIIIV), то есть из потенциальных повреждения переходят в летальные [12]. Однако в популяциях обоих видов подорожника изменения частоты дицентриков не происходит (р >> 0,05; рис. 6; стр. VI).

Не обнаружены отличия в частоте ацентрических фрагментов в опытных и контрольных популяциях A. maculatus (F = 0,98, ν = 27, р >> 0,05; рис. 7; стр. VI), в тоже время, в опытных популяциях P. lanceolata наблюдается достоверное увеличение частоты этого вида аберраций по сравнению с контрольными (p < 0,01; рис. 7; стр. V). Однако в хронически облучаемых популяциях P. media отмечено достоверное (р < 0,001) снижение частоты ацентрических фрагментов по сравнению с незагрязненными радионуклидами популяциями.

Как известно, растения с большей плоидностью обладают повышенной неспецифической устойчивостью к действию экстремальных абиотических факторов среды обитания, например, в более высоких широтах преобладают полиплоидные формы, имеющие селективные преимущества по сравнению с диплоидными [18]. Дисперсионный анализ показал достоверное (F = 15,0; ν = 1500; р < 0,001) влияние фактора плоидности на радиоадаптивный ответ исследованных растений: у P. media отмечена меньшая частота аберрантных анафаз как в контрольных (р < 0,001), так и в опытных (р < 0,01) популяциях по сравнению с популяциями P. lanceolata, произрастающими в таких же экологических условиях.


3.1.2 Влияние неравномерного фракционированного облучения на прозанник пятнистый (Achyrophorus maculatus L.)

Из результатов двухфакторного дисперсионного анализа следует, что как хроническое облучение (p < 0,01), так и различным образом организованное дополнительное радиационное воздействие (p << 0,001), а также сочетания этих факторов достоверно (p << 0,001) изменяют радиобиологический ответ исследованных растений.


3.1.2.1 Влияние на индуцированный мутагенез γ-лучей 60Со в дозе 5 Гр

Облучение в дозе 5 Гр в контрольных популяциях не вызывает достоверного изменения частоты как аберрантных анафаз (td = 1,56, ν = ∞, р >> 0,05; рис. 8; стр. VIII), так и частоты дицентриков (Fφ = 1,56, ν = ∞, р >> 0,05; рис. 9; стр. IX) и ацентрических фрагментов (F = 0,94, ν = 18, р >> 0,05; рис. 10; стр. IX). Данные факты позволяют дозу γ-лучей в 5 Гр считать малой для данного вида.

В опытных популяциях частоты аберрантных анафаз (td = 6,77, ν = ∞, р < 0,001; рис. 8; стр. VIII) и ацентрических фрагментов (F = 27,08, ν = 19, р < 0,001; рис. 10; стр. IX) достоверно возрастают, но частота дицентриков не изменяется (Fφ = 0,69, ν = ∞, р >> 0,05; рис. 9; стр. IX).

3.1.2.2. Влияние на индуцированный мутагенез γ-лучей 60Со в дозе 30 Гр

Влияние провокационной дозы в 30 Гр на опытную и контрольную популяции проявляется в достоверном увеличении как частоты аберрантных анафаз (р < 0,001), так и общей частоты аберраций (дицентрики + фрагменты). Между контрольной и опытной популяциями по указанным показателям различий не наблюдается (p >> 0,05), что свидетельствует о достаточности этой дозы для возникновения устойчивого цитогенетического эффекта. В то же время, обращает на себя внимание отсутствие различий в эффектах доз в 30 и 5 Гр в опытной популяции, что может свидетельствовать, на наш взгляд, о действии дополнительных не учитываемых факторов при воздействии малой дозой (рис. 8).


3.1.2.3 Значение временной организации фракционированного облучения в формировании радиологического эффекта

Реакции, возникающие в облученной клетке, подчиняются кинетическим закономерностям, скорость достижения конечного состояния будет определяться не только скоростью прямых, но и скоростью обратных реакций (процессов восстановления). Кинетика процесса будет зависеть от ингибиторов и катализаторов реакции, наличия веществ, обрывающих цепные процессы и других условий [9].

Из данных [20] следует, что существует два механизма адаптивного ответа у растений. Первый – это повышение способности репарировать повреждения ДНК после воздействия малой дозой. Второй – стимулированная репопуляция – феномен, заключающийся в замещении поврежденных клеток неповрежденными.

При часовом интервале между фракциями в контрольных популяциях наблюдается радиологический эффект, подчиняющийся принципу аддитивности: эффекты двух фракций суммируются, так как получено достоверное (p < 0,001) увеличение частоты аберрантных анафаз по сравнению с эффектом дозы в 30 Гр. В опытной популяции не обнаружено отличий между аналогичными вариантами (p > 0,05; рис. 8). Представленные данные свидетельствуют, что у растений из опытной популяции процессы восстановления протекают интенсивнее, что может быть объяснено приспособлением к действию повышенного фона радиации.

В обеих исследованных популяциях наблюдается достоверное снижение частоты аберрантных анафаз при увеличении интервала между фракциями (p < 0,001). Следует обратить внимание, что в опытной популяции частота аберрантных анафаз в варианте с суточным интервалом между фракциями достоверно (Fφ = 4,21, ν = ∞, р < 0,05) меньше, чем в контроле. Данные явления могут быть объяснены процессом стимулированной репопуляции, более интенсивно протекающим в растениях из загрязненной популяции.


3.2 Биохимические исследования


Результаты биохимических исследований представлены в таблице 3 и на рисунках 11, 12 (стр. X), из которых следует, что при добавлении 0,2 мл надосадочной жидкости, содержащей антиоксидантные ферменты, достоверно снижается расход йода (р < 0,01), свидетельствующий о работе антиоксидантных систем. Эти же данные говорят о том, что в пробах обоих видов подорожника, обитающих на загрязненных территориях, антиоксидантные системы работают активнее (p < 0,001). Кроме того, у вида с 2n = 24 (P. media) по сравнению с видом с 2n = 12 (P. lanceolata) расход йода в высшей степени достоверно ниже как в опытных, так и в контрольных вариантах (p < 0,001) (рис. 12). Сказанное свидетельствует о том, что, во-первых, хроническое низкоинтенсивное γ-облучение, вызывающее образование в цитоплазме пероксидов и свободных радикалов, способно активировать антиоксидантные системы у облучаемых растений; во-вторых, у растений с большей плоидностью антиоксидантные ферменты либо активнее, либо присутствуют в клетках в большем количестве. Представленные данные доказывают предположения авторов [16], что характеристики окислительно-восстановительного метаболизма являются основными физиологическими детерминантами радиорезистентности организмов к длительному низкоинтенсивному воздействию.

Вопрос о природе повышенной радиоустойчивости хронически облучаемых популяций растений остается открытым. Несмотря на то, что действие повышенного фона радиации, индуцирующего накопление мутационного груза, в исследованных районах имеет место уже в течение полувека, специфического приспособления к мутагенному действию данного экологического фактора у организмов не выработалось. Одним из ведущих механизмов выступает активация хроническим β- и γ-облучением репарационных систем [3, 17]. На выход индуцированных мутаций влияют генотипические различия организмов, которые обязательно имеют место как внутри популяций, так и между популяциями в особенности. Далее, вновь возникающие наследственные изменения в природных условиях будут подвергаться естественному отбору, направленному, прежде всего на повышение радиоустойчивости [2, 4, 19, 24]. По мнению ряда авторов [2, 3, 4, 19], ионизирующие излучения способны выступать не только мутагенным, но и новым экологическим фактором, отбирающим радиорезистентные фенотипы и гаметы, содержащие оптимальные геномы [2, 19]. Кроме того, из полученных нами данных следует, что еще одним механизмом радиопротекторного эффекта является активация антиоксидантных систем, разрушающих продукты радиолиза воды и органических веществ. Выяснено, что у растений с большей плоидностью радиопротекторный эффект выражен существенно ярче, объясняющий более низкий уровень спонтанного мутагенеза у подобных растений (рис. 5, стр. V; рис. 12, стр. X).



Заключение


На основании полученных и проанализированных результатов можно сделать следующие выводы:

  1. Хроническое облучение в течение 50 лет приводит к достоверному повышению уровня мутационного процесса в популяциях многолетних растений: Achyrophorus maculatus и Plantago media. В то же время, в популяциях Plantago lanceolata аналогичный эффект отмечен на уровне тенденции.

  2. Радиорезистентность высших растений на примере родственных видов подорожника зависит от их плоидности: вид с 24 хромосомами (P. media) оказывается более радиорезистентным по сравнению с видом с 12 хромосомами (P. lanceolata).

  3. Впервые на высших растениях показана повышенная эффективность работы антиоксидантных систем у полиплоидных форм, вероятно, объясняющаяся их большей неспецифической устойчивостью.

  4. В обеих популяциях (контрольной и опытной) A. maculatus в вариантах с часовым интервалом между фракциями радиационный эффект подчиняется принципу аддитивности, в то же время, при суточном интервале между фракциями индуцируется высоко достоверный радиопротекторный эффект, особенно ярко проявляющийся в опытной популяции.

  5. Радиопротекторные механизмы хронического и предварительного низкоинтенсивного облучения схожи, и основными из них являются: а) активация репарационных систем; б) отбор наиболее радиорезистентных фенотипов и гамет с оптимальным геномом; а также в) активация антиоксидантных систем растений, длительное время обитающих в условиях хронического низкоинтенсивного облучения.



Список использованной литературы


  1. Lane J.K.. X-ray fractionation and chromosome breakage.//Heredity, v. 5, 1951, p. 1-35.

  2. Абрамов В.И., Кальченко В.А. и др. Цитогенетические эффекты в популяциях растении, произрастающих на Восточно-Уральском радиоактивном следе (ВУРСе).// Международная конференция «Генетические последствия чрезвычайных радиационных ситуаций», М., 10-13 июня 2002 г. М., РУДН, 2002: 5.


Случайные файлы

Файл
161770.rtf
30220.rtf
34573.rtf
13621-1.rtf
38027.doc




Чтобы не видеть здесь видео-рекламу достаточно стать зарегистрированным пользователем.
Чтобы не видеть никакую рекламу на сайте, нужно стать VIP-пользователем.
Это можно сделать совершенно бесплатно. Читайте подробности тут.