Проведение гематологического обследования рыб (14099)

Посмотреть архив целиком

      МИНИСТЕРСТВО                                                                                                                  
СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
    И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ                                                                                                     Департамента ветеринарии
     (Минсельхозпрод России)

Заместитель руководителя
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ                                                                         Селиверстов В.В.

ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ                                                                                             
 

02.02.99 г. № 13-4-2-/1487

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
по проведению гематологического обследования рыб

1. Общие положения

Необходимым условием успешного ведения интенсивного рыбоводства и воспроизводства ценных видов рыб является тщательный контроль за физиологическим состоянием объектов выращивания. Кровь, как наиболее лабильная ткань, быстро реагирует на действие различных факторов и приводит к восстановлению равновесия между организмом и средой. Поэтому для ранней диагностики заболевании, в том числе и незаразных, наряду с паразитологическими, микробиологическими и вирусологическими исследованиями важное значение имеет анализ крови.

В рыбоводстве при гематологическом исследовании принято определять следующие показатели крови:

- количество гемоглобина,

- величину гематокритного числа,

- содержание общего белка в сыворотке крови,

- число эритроцитов,

- содержание гемоглобина в одном эритроците,

- средний объем эритроцитов,

- скорость оседания эритроцитов,

- число лейкоцитов,

- лейкоцитарную формулу,

- количество метгемоглобина.

В приложении приведена таблица, содержащая показатели крови здоровых рыб, и рисунки форменных элементов крови.

2. Взятие крови

2.1. Оборудование и реактивы:

- шприц с инъекционными иглами - стерильные,

- пастеровские пипетки - стерильные,

- часовое стекло,

-5 % раствор натрия цитрата или 0,2 % раствор гепарина (1.000 ЕД/мл),

- анестстики,

- спирт,

- мардя, вата.

2.2. Материал для исследования, ход работы Кровь берут у голодной рыбы, выдержанной в хорошо аэрированной воде в течение 5-10 минут после отлова. Если это невозможно, то пойманную рыбу следует сразу помещать в ведро с водой из водоема в соотношении 1:10, содержащей релаксирующую концентрацию одного из ансстетиков: пропаксат (0,6 - 0,8 мг/л), хиналдин (25 - 30 мг/л), серный эфир (1-1,5 %) и др. Вода, в которой находится анестезированная рыба, должна постоянно аэрироваться.

В зависимости от размера объекта и необходимого количества крови кровь берут несколькими способами: из сердца, жаберной вены, хвостовой артерии, отсечением хвоста.

Место пункции после снятия чешуи обрабатывают 70° спиртом и высушивают ватньм тампоном для удаления слизи. Для взятия крови чаще используют шприц с инъекционной иглой либо пастеровскую пипетку. Инструменты предварительно обрабатывают водным раствором антикоагулянтов: цитрата натрия или гепарина. Место взятия крови нельзя сжимать во избежание попадания тканевой жидкости, искажающей результаты. Повторно брать кровь из одного и того же места не рекомендуется. Анализируемая кровь должна быть свежей, жидкой. Во избежание разрушения эритроцитов (гемолиза) кровь берут в подготовленные пробирки (или часовое стекло), сливая осторожно по стенке.

3. Приготовление и окраска мазков крови

По окрашенным мазкам крови ведут оценку активности эритропоэза и учет лейкоцитов.

3.1. Оборудование и реактивы:

- обезжиренные предметные стекла,

- шлифованное стекло для изготовления мазка,

- краска Май-Грюнвальда,

- рабочий раствор краски азур-эозина (по Романовскому),

- дистиллированная вода с рН 6,8 - 7,1, нейтрализованная фосфатными буферами.

3.2. Подготовка к исследованию

3.2.1. Подготовка предметных стекол.

- один конец стекла размером в 1-1,5 см шлифуют на наждаке для надписи простым карандашом,
- стекла кипятят в 1 %-ном растворе двууглекислой соды - 10 мин,
- охлаждают и промывают водопроводной, а затем дистиллированной водой - 5 мин.,
- стекла помещают в слегка подкисленный соляной кислотой раствор дистиллированной воды на 2-3 мин; затем дважды промывают дистиллированной водой, высушивают на воздухе или в сушильном шкафу и хранят в смеси спирта с эфиром 1:1. Перед употреблением их вынимают, насухо вытирают чистой салфеткой или фильтровальной бумагой. Они готовы к использованию.

3.2.2. Приготовление рабочего раствора краски азур - эозина:

- 5,5 мл концентрированной краски азур - эозина помещают в 250 мл нейтральной дистиллированной воды и тщательно перемешивают.

3.3. Ход работы.

Кровь после взятия (см. п. 2.) наносят в виде небольшой капли на заранее приготовленное обезжиренное предметное стекло, на расстоянии 1,5-2 см от его шлифованного края. Большим и указательным пальцами правой руки берут шлифованное стекло за боковые ребра, ставят на предметное стекло под углом 45° и подвигают тыльной стороной к капле, которая от соприкосновения растекается. Скользящим движением продвигают шлифованное стекло вперед. Кровь должна равномерно распределяться по предметному стеклу в виде мазка. От каждой рыбы готовят не менее двух мазков. После приготовления мазка его высушивают на воздухе в течение 10-15 минут.

Подсохшие мазки без фиксации окрашивают по Паппснгсйму (Романовскому - Гимза). Первый этап - окрашивание и фиксация одновременно раствором Май-Грюнвальда в течение 5 минут, затем промывают нейтральной дистиллированной водой. Второй этап - докрашивание в рабочем растворе Романовского 30-40 минут. Качество окраски клеток контролируют под малым увеличением микроскопа. Окрашенные мазки промывают водопроводной водой и высушивают на воздухе.

4. Определение содержания гемоглобина

Гемоглобин - это дыхательный пигмент, содержащийся в эритроцитах. Его количество в организме выражается в г/л и имеет важное диагностическое значение. Определять содержание гемоглобина можно двумя способами: по Сали и цианметгемоглобиновым методом. Наиболее распространенным и простым является метод определения гемоглобина по Сали. Однако он дает ряд объективных (постепенное усиление окраски) и субъективных (визуальное сравнение цвета) ошибок. Цианметге-моглобиновьга метод является наиболее точным.



4.1. Метод определения гемоглобина по Сали .

4.1.1. Подготовка к исследованию

Приготовление 0,1 н. раствора соляной кислоты:

- на 1 л дистиллированной воды добавляют химически чистой 8,2 см3 соляной кислоты с удельным весом 1,19, либо 0,1 н. фиксанал соляной кислоты.

4.1.2. Оборудование и реактивы

- гемометр Сали,

- капиллярная пипетка от гемометра Сали,

- глазная пипетка,

- стеклянная палочка,

- часовое стекло,

- 0,1 н. раствор соляной кислоты,

- дистиллированная вода.

4.1.3. Ход определения и учет результатов В градуированную пипетку гемометра Сали до метки "2" глазной пипеткой наливают децинормальньгй раствор соляной кислоты. В капиллярную пипетку от гемометра Сали набирают кровь до метки 20 мкл и выдувают ее в раствор соляной кислоты. Полученную смесь перемешивают стеклянной палочкой и оставляют на 10 минут. По истечении этого времени в пробирку по каплям доливают дистиллированную воду и, перемешивая стеклянной палочкой, подбирают цвет рабочего раствора до совпадения с цветом жидкости в стандартных пробирках. Количество ге-моглобина отсчитывают по нижнему мениску рабочего раствора на градуированной пробирке (показатели в г % выражают в г/л), 1 г % равен 10 г/л.

4.2. Цианметгемоглобиновый фотометрический метод

4.2.1. Подготовка к исследованию.

Приготовление раствора Драбкина, на 1 л реактива берут:

Бикарбонат натрия - 1 г, красная кровяная соль

- 0,2 г, цианистый калий или натрий - 0,05 г, дистиллированная вода

-остальной объем.

4.2.2. Оборудование и реактивы:

- фотоэлектроколориметр (ФЭК) или спектротометр с зеленым светофильтром и кюветами толщиной 1 см;

- химические пробирки с пробками;

- капиллярная пипетка от гсмометра Сали объемом 20 мкл;

- градуированная пипетка на 5 мл;

- раствор Драбкина.

4 2.3. Ход определения и учет результатов.

Мерной пипеткой в пробирку наливают 5 мл трансформирующего раствора Драбкина. Пипеткой от гемометра Сали добавляют 20 мкл крови. Содержимое пробирки хорошо перемешивают и оставляют в холодильнике на 20 минут. По истечению этого времени рабочий и трансформирующий растворы наливают в кюветы и, используя зеленый светофильтр, проводят измерения на ФЭКе. Расчет концентрации гемоглобина (г/л) на основе данного определения проводят по формуле:

x=d540 x 367,1 г/л,

где: d 540 - показания ФЭК; 367,1 - коэффициент пересчета, учитывающий разведение крови, миллимолярный вес гемоглобина и другие показатели.

5. Определение гематокритной величины

Гематокритное число - это отношение объема эритроцитов к общему объему крови, выраженное в л/л (1 л/л равен 100 %).

5.1. Подготовка к исследованию.

Приготовление растворов антикоагулянта:

- раствор Геллера и Пауля:

- на 100 мл воды: щавелевокислый аммоний - ],2 г, щавелевокислый калий - 0,8 г;

- 5 % раствор трсхзамсщенного лимоннокислого натрия.

5.2. Оборудование и реактивы:

- микрокапилляры,


Случайные файлы

Файл
47070.rtf
38549.rtf
5621-1.rtf
47004.rtf
175779.rtf




Чтобы не видеть здесь видео-рекламу достаточно стать зарегистрированным пользователем.
Чтобы не видеть никакую рекламу на сайте, нужно стать VIP-пользователем.
Это можно сделать совершенно бесплатно. Читайте подробности тут.