Процессинг РНК. Теломеры и теломераза (10443)

Посмотреть архив целиком

ЛЕКЦИЯ

ПРОЦЕССИНГ РНК


Процессинг РНК у эукариот

Итак у эукариотов первоначальный «транскрипт» с ДНК значительно больше, чем зрелая РНК. Наряду со «значащими» участниками рибонуклеотидной последовательности транскрипта, так называемыми «экзонами», которые войдут в готовую молекулу РНК, в нем имеются и лишние, «молчащие» участки — «интроны», подлежащие удалению (прозрачка 18). Заметим, что у эукариотов соотношение интроны/экзоны (по длине) равно 9:1. Для прокариотов —соотношение обратное, 1:9.

Все интроны транскрибируются в составе РНК-предшественника и впоследствии удаляются в процессе разрыва-воссоединения – сплайсинга. Сплайсинг происходит еще в ядре, перед выходом РНК в цитоплазму. При этом должна быть сохранена (или установлена) правильная рамка считывания. Явление сплайсинга у эукариотов не позволяет по аминокислотной последовательности белка восстановить последовательность нуклеотидов в кодирующем его участке ДНК. У прокариотов, к счастью, явление сплайсинга наблюдается редко, и соответствие последовательностей РНК и ДНК, как правило, сохраняется.

Выделяют четыре вида интронов, и, соответственно, четыре механизма сплайсинга


Виды интронов

  1. Интроны генов ядерных мРНК.

Первыми были обнаружены интроны в ядерных генах, кодирующих белки. Их размер варьирует от 100 п.н. до 10 т.п.н. и более. Наиболее характерной отличительной чертой всех этих интронов является наличие специфических последовательностей вблизи их 5`- (левой, или донорной) и 3`-(правой, или акцепторной) концов (т.е. на стыках интронов и экзонов или в сайтах сплайсинга).

Нуклеотидные последовательности в местах соединения экзонов и интронов весьма консервативны и практически одинаковы во всех генах ядерных мРНК почти у всех изученных видов (прозрачка 20). 5`-сайт сплайсинга чаще всего фланкирует последовательность ЦRГ (где R - пурин), а 3`-сайт – всего один остаток Г. тем не менее последовательности фланкирующие интроны извне могут значительно варьировать, а мутации в них никогда не предотвращают сплайсинг, хотя и могут влиять на его скорость. Первыми двумя нуклеотидами на 5`-конце интрона в РНК почти всегда являются ГУ (исключение, ГЦ, встречается всего в двух случаях); следующие четыре нуклеотида могут немного варьировать, но, по-видимому, канонической является последовательность АГАГУ. Замена остатка Г или У в месте сочленения обычно блокирует сплайсинг, а замена соседних оснований влияет на сплайсинг по-разному. Указанные шесть нуклеотидов на 5`-конце интрона и определяют специфическую функцию 5`-сайта сплайсинга. На 3`-конце интрона всегда находится пара АГ. Мутации, приводящие к замене константных А и Г на другие основания, также блокируют сплайсинг в этом сайте.

Остаток А вблизи 3`-конца интрона играет важную роль в сплайсинге ядерных промРНК. В интронах млекопитающих этот остаток не находится в фиксированном положении или в какой либо определенной последовательности, поскольку его роль вероятно, может играть любой из нескольких остатков А, расположенных на участке от 18 до 37 нуклеотида перед 3`-сайтом сплайсинга. Однако мутации, которые затрагивают соседствующие с указанным остатком А последовательности, приводят к существенному уменьшению эффективности сплайсинга in vitro; следовательно, хотя этот остаток и не принадлежит какой-то определенной последовательности его окружение влияеть на сплайсинг.

В интронах могут содержаться разные генетические элементы, например энхансеры, другие гены, возможно, сигналы репликации и упаковки хромосомы или последовательности, необходимые для упаковки промРНК в рибонуклеотидные частицы.

Сплайсинг ядерной про мРНК.

Сплайсинг ядерной про мРНК осуществляется в ядре, возможно, одновременно с транскрипцией для одних генов, и лишь после завершения транскрипции для других.

Цис-сплайсинг. Первым этапом сплайсинга является сборка комплекса сплайсинга. Самые ранние продукты, обнаруживаемые в процессе сплайсинга in vitro образуются в результате точного расщепления в 5`-сайте сплайсинга один из них содержит 5`-экзон, а другой – интрон и 3`-экзон (прозрачка 22). Расщепление в 5`-сайте должно предшествовать расщеплению в 3`-сайте. В ходе реакции накапливаются два продукта: правильно лигированные экзоны и свободный целый интрон. Как продукт начального расщепления, так и вырезанный интрон содержат структуры типа лассо.

Вырезанию интрона в форме лассо и лигированию двух экзонов для сплайсинга ядерных про мРНК требуется множество ядерных факторов-белков и рибонуклеопротеидных комплексов (мяРНП). Комплекс, состоящий из множества субъединиц, который катализирует сплайсинг, называют сплайсингосомой. Сплайсингосома состоит из интрона, связанного по меньшей мере с пятью разными мяРНП и некоторыми вспомогательными белками, обычно не связанными с этими мяРНП. Сплайсингосомы образуются путем спаривания молекул РНК, присоединения белков к РНК и связывания этих белков друг с другом (прозрачка 23). Конечный результат сплайсинга в случае про мРНК: интрон вырезается, а фланкирующих его экзона соединяются.

Транс-сплайсинг. До сих пор, говоря о сплайсинге, мы рассматривали внутримолекулярные, или цис-реакции. А существует ли межмолекулярный или транс-сплайсинг? Иными словами, может ли происходить легирование двух экзонов, находящихся в разных молекулах РНК, с одновременным удалением фланкирующих их интронов? Транс-сплайсинг является важным этапом внутриклеточного образования всех мРНК у Tripanosoma (прозрачка 25). Кроме того, возможность межмолекулярного сплайсинга продемонстрирована в опытах in vitro (прозрачка 24).

  1. Интроны в генах тРНК. Размер интронов в генах тРНК колеблется от 14 до примерно 60 нуклеотидов, но они локализуются всегда в одном и том же месте: через один нуклеотид от 3`-конца антикодона (прозрачка 26). Как правило, если ген данной тРНК имеет интрон, то все другие гены в пределах вида кодирующие эту тРНК тоже содержат такой же интрон. Однако у генов, кодирующих разные тРНК внутренний и фланговый участки интронов заметно различаются. Установлено, что удаление интрона гена супрессора тРНКтир при помощи направленного мутагенеза не влияет на способность к экспрессии при введении в клетки. И все же, весмотря на то, что эта тРНК транскрибируется и процессируется нормально, остаток У в антикодоне не модифицируется как обычно с образованием ψ. Является ли это указанием на роль интронов в посттранскрипционной модификации тРНК или мы имеем дело с уникальным свойством тРНКтир – не ясно.

Сплайсинг тРНК. Механизм удаления интронов в тРНК лучше всего изучен у дрожжей, но некоторая информация есть в опытах с другими низшими эукариотами и растениями.

Задача состоит в том, что нужно вырезать интрон в антикодоновой петле. У дрожжей (прозрачка 26) здесь включаются специфические ферменты – эндонуклеазы, которые узнают эти последовательности и расщепляют про-тРНК в обоих сайтах сплайсинга с образованием указанных концов, полифункциональный белок, который катализирует все реакции кроме фосфатазной, 2`фосфатазы, лигазы и АТФ (в этом случае в месте сочленения обоих экзонов находится фосфатная группа, которая до этого была концевым фосфатом АТФ ). У позвоночных (прозрачка 27) три указанные реакции катализируют отдельные ферменты. При этом каждый фермент участвует только в сплайсинге тРНК. Отметим, что фосфат в месте соединения двух экзонов ранее находился в месте сочленения экзона и интрона.

  1. Особые типы интронов: группа I.

Гены ядерных рРНК некоторых низших эукариот содержат особые интроны и имеют уникальный механизм сплайсинга. Подобные интроны обнаружены во многих генах, но ни один из них не был выявлен в генах позвоночных.

Интроны группы I отличаются друг от друга по размеру, они имеют ряд общих свойств:

А) они сами катализируют свой сплайсинг, который может протекать in vitro в отсутствии каких-бы то ни было белков;

Б) информация, необходимая для сплайсинга, содержится во множестве относительно коротких внутренних последовательностей внутри интрона, которые обеспечивают укладку молекулы с образованием характерной пространственной структуры.

В) сплайсинг инициируется свободным гуанозином или любым из его 5`-фосфорелированных производных

Г) конечными продуктами сплайсинга являются рРНК и линейная РНК, размер которых несколько меньше, чем размер интрона.

Самосплайсинг интронов группы I . про-рРНК, прототип интрона группы I осуществляется при участии последовательных реакций трансэтерификации, в которых акты фосфодиэфирного обмена не сопровождаются гидролизом. (прозрачка 28).

  1. Особые типы интронов: группа II.

Интроны группы II распространены менее широко. Они обнаружены в двух митохондриальных генах дрожжей, кодирующих одну из субъединиц цитохромоксидазы и цитихром b; интересно, что в этих генах присутствуют также интроны группы I.

Сплайсинг интронов группы II.

Интроны группы II также подвергаются самосплайсингу in vitro, но в этом случае реакция инициируется не экзогенным гуанозином, а остатком входящим в состав самого интрона (прозрачка 29) Интроны группы II, высвобожденные после сплайсинга представляют собой лассоподобные структуры, в которых 5`-концевой фосфат РНК интрона соединен фосфодиэфирной связью с 2`-гидроксильной группой внутреннего нуклеотида.

Альтернативный сплайсинг

При сплайсинге большей части про-мРНК каждый интрон вырезается в соответствующих 5`-и 3`-сайтах сплайсинга. В результате все экзоны и порядок их расположения в транскрипте сохраняются в зрелой мРНК и образуют непрерывную последовательность (конститутивный сплайсинг). Однако сплайсинг некоторых про-мРНК протекает по-разному с образованием семейства близких по строению мРНК, каждая из которых состоит из специфического набора экзонов и кодирует одну из изоформ белков одного семейства. Такой способ процессинга РНК называется альтернативным сплайсингом (прозрачка 30). Растет число генов из разных организмов, от Drosophila до человека и их вирусов, о которых известно, что при созревании их про-мРНК используется альтернативный сплайсинг. Эти гены кодируют многие белки, в том числе некоторые белки, участвующие в формировании цитоскелета, мышечном сокращении, сборке мембранных рецепторов, пептидных гормонов, в промежуточном метаболизме и транспозиции ДНК (перемещение некоторых сегментов ДНК в другие геномные локусы).


Случайные файлы

Файл
141002.rtf
70666.rtf
87868.doc
180747.rtf
12634-1.rtf




Чтобы не видеть здесь видео-рекламу достаточно стать зарегистрированным пользователем.
Чтобы не видеть никакую рекламу на сайте, нужно стать VIP-пользователем.
Это можно сделать совершенно бесплатно. Читайте подробности тут.