Стандартные препараты и эффекты матрикса (93927)

Посмотреть архив целиком












Стандартные препараты и эффекты матрикса


ВВЕДЕНИЕ


В этой работе обсуждается проблема приготовления стандартов и матрикса, а также их влияние на стандартизацию иммуноанализа. Стандартизация базируется на применении определенных принципов и обычно включает в себя оценку систематических ошибок, точности, воспроизводимости и сопоставимости данного метода с другими. Независимо от того, насколько усложнена или, наоборот, упрощена новая аналитическая система, при ее стандартизации должны соблюдаться одни и те же принципы. Непонимание этих принципов и пренебрежение ими приводят к серьезным ошибкам.

Таким образом, в данную работу включены следующие вопросы: 1) проблемы, связанные с так называемым матриксным эффектом; 2) другие факторы, иногда ошибочно приписываемые матриксыому эффекту; 3) последствия замены одного международного стандарта на другой; 4) ограничения при использовании моноклональных антител; 5) проблемы приготовления контрольных матриксов для гаптенов; 6) некоторые новые и разрабатываемые стандарты Национального института биологических стандартов и контроля (NIBSC).

Стандартизация иммуноанализа необходима для 1) улучшения точности диагноза и мониторинга заболеваний; 2) выбора общих критериев для диагноза заболеваний; 3) возможности прямого сравнения эффективности различных иммунодиагностических наборов.

Прежде чем перейти к обсуждению указанных вопросов, хотелось бы обратиться с просьбой к читателям прочесть данный раздел до конца, каким бы сухим и скучным он ни показался.


ПРОБЛЕМА МАТРИКСА


Различные способы сравнения свидетельствуют, что обычно разные методы иммуноанализа дают хорошо согласующиеся между собой результаты. Однако иногда результаты определения конкретного вещества с помощью данного метода выходят за разумные пределы. Например, два года назад в одной из стран применение нескольких готовых наборов постоянно приводило к существенно отличающимся результатам определения тиреотропного гормона (TSH) в плазме. Представители компаний, выпускающих эти наборы, решили, что расхождения в результатах анализа могли возникнуть из-за применения различных по составу растворов для разведения международного стандарта. Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ)* было предложено разработать метод изучения эффекта различных матриксов. Затем ВОЗ совместно с Международной организацией клинической химии (IFCC) провела специальный симпозиум по данной проблеме, на котором были предложены пути улучшения сопоставимости результатов различных методов иммуноанализа.

Калибровка иммунодиагностических наборов. Для калибровки любого набора для анализа каждая фирма, выпускающая такие наборы, имеет систему первичных и вторичных стандартов. Первичный контрольный стандарт обычно состоит из алик-вот, взятых из серии разбавлений стандарта. Каждая аликвота содержит известное количество определяемого вещества и хранится при очень низкой температуре. Эти аликвоты используются для калибровки рабочих стандартов, которые в свою очередь применяют для калибровки выпускаемых наборов. Определяемое вещество в первичном стандарте может быть или известным количеством чистого химического соединения, или полипептидом, содержание которого выражено в единицах международного биологического стандарта, или препаратом, калиброванным по данному пептиду. Для разбавления стандарта часто используют сыворотки, буферные растворы и растворы, содержащие белок-носитель. Состав этих растворов, или, как их еще называют, матриксов, может влиять на реакцию антиген - антитело, в результате чего и появляются систематические ошибки и непостоянство результатов анализа. Это явление называют "матриксным эффектом". Принцип сопоставимости анализов заключается в том, чтобы анализируемое вещество в пробе взаимодействовало в тех же условиях, что и в стандартном растворе. Молекулярное окружение определяемого вещества в обоих растворах должно быть идентичным или очень близким по составу; только тогда можно точно определить его концентрацию. Определение большинства веществ проводится в сыворотке, и, несомненно, матриксные эффекты связаны с типом и способом обработки материала, используемого для разбавления стандартов. Ясно, что такой матриксный эффект отличен от эффектов, обусловленных прис> гствием аутоантител, лекарственных препаратов, опухолевых клеток или необычно высоких концентраций предшественников или метаболитов определяемого вещества.

Матриксные эффекты чаще всего влияют на определение ти-реотропина (TSH), общего тироксина (Л4), общего трииодотиро-нина (Из), пролактина, фолликулостимулирующего гормона (FSH), лютеинизирующего гормона (LH) и стероидов (кортизола, прогестерона и тестостерона, если они предварительно не выделены из пробы экстракцией).

Другие возможные источники систематических ошибок. Другие связанные с проблемами стандартизации причины расхождений в результатах анализа могут быть обусловлены 1) различиями в молекулярной структуре определяемого вещества или веществ в пробе и стандартном растворе (по сути дела, в этом случае сравниваются разные соединения); 2) различиями в составе, способе хранения и стабильности стандартов, используемых фирмами-поставщиками в качестве первичного и рабочего стандартов, а также стандарта для наборов; 3) систематическими ошибками, связанными с различной специфичностью анализа на каждой стадии калибровки; 4) ошибками при технических операциях (например, при разбавлении растворов), а также неудачной оптимизации условий анализа, особенно при разделении свободного и связанного с антителами вещества.

Различия в молекулярной структуре чистых химических соединений могут быть обусловлены присутствием изомеров, связывание которых с белками плазмы может происходить иначе, чем у гаптенов, обладающих только нативной пространственной конфигурацией. В этом случае при приготовлении стандартов не помогает и добавление экзогенного стероида к сыворотке. Кроме того, отношение связанного с белком и свободного определяемого вещества может изменяться в зависимости от условий анализа, например рН или ионной силы. Наконец, небольшие различия в методах выделения определяемого вещества из физиологических жидкостей могут быть источниками разброса и систематической ошибки результатов анализа.

Молекулярная гетерогенность стандартов. ВОЗ установлены международные стандарты, контрольные препараты или контрольные реагенты для двух групп сложных биологических соединений: 1) соединений (например, пептидных гормонов), которые можно очистить и определить количественно с помощью биологических анализов; 2) веществ (например, ферритина или субъединиц гликопротеиновых гормонов), которые в настоящее время можно определить только по их иммунологической активности.

Международные стандарты для соединений первой группы обычно содержат препараты очищенного гормона и белок-носитель. Такой состав стандартов позволяет охарактеризовать их с помощью как определенных методов биоанализа in vivo или in vitro, так и физико-химических методов. Эти методы используются для идентификации и количественного определения таких веществ [1 ].

Другой причиной несоответствия между стандартами является природная гетерогенность молекулярной структуры, которая наиболее часто наблюдается в случае гликопротеиновых гормонов (TSH, FSH, LH), а также пролактина и гормона роста. Содержание изогормонов изменяется в зависимости от источника и способа получения.

Молекулярная структура определяемого вещества может изменяться при лиофилизации, которая почти всегда включается в методики приготовления международных и большинства вторичных стандартов. Такие изменения можно обнаружить и оценить количественно с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и изоэлектрического фокусирования. Можно выделить два обычных типа денатурации: 1) необратимая деформация молекулы белка из-за пересушивания; 2) образование комплексов между пептидом и носителем, например лактозой, манни-том и трёгалозой.

И наконец, не менее важным фактором является собственная нестабильность определяемого вещества в стандарте. Причина, природа и степень изменений структуры многих сложных белков (дезаминирование, окисление, изменение конформации), которые происходят при их хранении, очень мало или совсем не изучены, а часто просто игнорируются.

В иммуноанализе стандарт обычно растворяют или разбавляют матриксом, аналогичным тому, в котором растворена проба, содержащая определяемое вещество.

Матриксы. Для различных определяемых веществ в качестве матриксов используют разнообразные материалы, причем их состав зависит от изготовителя. Наиболее часто используемые матриксы включают цельную сыворотку или плазму человека, содержащие определяемое вещество в физиологических или патологически низких концентрациях. Иногда матриксы получают из свежей крови, но гораздо чаще для этого используют препараты плазмы человека, которые уже непригодны для трансфузии. Кроме того, в качестве матриксов применяют сыворотки животных и препараты альбумина человека или животных.

Перед использованием матриксы, особенно сыворотки, должны быть проверены на патогены, например, на поверхностный антиген вируса гепатита, а также соответствующим образом обработаны с целью удаления или снижения до минимума содержания определяемого вещества. Для этих целей используют обработку антителами, активированным углем, силикагелем и ионообменными смолами. Некоторые из этих методов и реагентов дают плохо воспроизводимые результаты; например, различные партии активированного угля имеют различные адсорбционные характеристики. Большинство методов, разработанных для удаления Определяемого вещества из сыворотки в промышленном масштабе, хранится в секрете.


Случайные файлы

Файл
68949.rtf
47192.rtf
158738.rtf
160584.rtf
ref-17822.doc




Чтобы не видеть здесь видео-рекламу достаточно стать зарегистрированным пользователем.
Чтобы не видеть никакую рекламу на сайте, нужно стать VIP-пользователем.
Это можно сделать совершенно бесплатно. Читайте подробности тут.